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工业化工论文范文红外光谱法研究胃蛋白酶在表面上的构象变化

来源:知实学术 分类:工业论文 发布时间:2020-11-10 浏览:

  摘 要 胃蛋白酶是哺乳动物的一种极其重要的消化酶,通过水解特定氨基酸间的肽键从而分解食物中的蛋白质。胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶,对周围环境的酸碱度比较敏感。本研究采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术研究了不同pH值和表面性质对胃蛋白酶二级结构的影响。结果表明,随着pH值的增大,β-折叠结构的比例先增加,在pH 3~7之间达到最大值,然后在溶液为碱性时降低,无规卷曲结构比例则与之相反。衰减全反射(ATR)晶体表面存在TiO2时,β-折叠结构含量远高于其它二级结构,且随着pH值变化,各二级结构比例没有明显的变化。通过对比吸收峰强度发现,胃蛋白酶与TiO2表面的相互作用有利于溶液中胃蛋白酶的吸附,表明基底表面的官能团对胃蛋白酶的构象也有影响。

  关键词 胃蛋白酶; 二级结构; pH值; 红外光谱; 二氧化钛

  《应用化工》(原:陕西化工)创刊于1972年,由陕西省科学技术厅和陕西省石油化工研究设计院、陕西省化工学会、陕西延长石油主办。

  1 引 言

  蛋白质是生物体的重要组成物质,在酶的催化、提供机械支持、物质的运输与储存等几乎所有的生命活动中具有重要的作用[1]。蛋白质的生物学功能是建立其结构之上的,所以蛋白质结构的研究很早就引起了研究者关注。目前,对于蛋白质结构的相关知识广泛建立在四级结构概念的基础上,其中二级结构是蛋白质三维结构的基础,它主要是由肽链上不同酰胺键间的羰基氧原子与氨基氢原子之间的氢键维系,从而使肽链骨架呈现出重复的规则构象[2]。

  研究蛋白质构象的方法中,圆二色谱(CD)[3]采用圆偏振光获得蛋白质的空间结构,核磁共振(NMR)[4]被用于解析蛋白质的化学结构,冷冻电镜(Cryo-EM)[5]可以观察蛋白质结晶结构。这些研究方法十分有效,但是在研究中或者破坏蛋白质的活性,或者样品制备方式比较复杂。

  红外光谱(FTIR)是研究多肽和蛋白质二级结构的一种常用技术[6~9]。相比上述方法,FTIR的样品制备简单,并且不会破坏蛋白质的结构,在测试时完全保留其活性,可以更加快速、方便、准确地得到蛋白质的二级结构信息[10,11],因此应用广泛。然而,水在红外光谱中有极强的吸收,而且吸收峰的位置和蛋白质的酰胺红外吸收特征峰重合。为了克服这个局限,研究者开发了衰减全反射(Attenuated total reflection,ATR)技术[12],利用红外光可以在晶体中发生全反射的物理现象,获得在晶体表面上附着的样品的红外信号,是一种表面分析技术。红外光是一种电磁波,在ATR晶体表面上形成倏逝波(Evanescent wave),从而进入表面上的样品一定深度,获得样品信息。由于表面上的水含量相对溶液中大大降低,因此,水对于样品的红外光谱影响也大大降低,可以通过软件处理进行消除。

  胃蛋白酶是由哺乳动物胃部的胃蛋白酶原在酸性条件下迅速转化形成[13],通过水解特定类型氨基酸之间的肽键,分解食物中的蛋白质,是消化系统中非常重要的蛋白水解酶[14]。胃蛋白酶主要存在于胃液中,其活性与pH值相关,在pH 5.0时仍具有蛋白水解活性[15]。

  蛋白质的生物学功能需要多肽链正确的折叠和足够的稳定性,然而在溶剂类型、离子强度等外界环境因素的影响下,蛋白质本身的结构会发生变化,甚至完全失活变性。胃蛋白酶的活性与周围环境的酸碱度密切相关,而胃蛋白酶活性是由自身的结构决定的。本研究考察了pH值对胃蛋白酶二级结构的影响。采用FTIR-ATR技术获取胃蛋白酶的光谱,胃蛋白酶附着在ATR晶体表面上,表面上的官能团有可能会影响胃蛋白酶的二级结构。本研究构建了一个TiO2表面,在水溶液中负载大量的羟基基团,这些羟基基团电离后,所携带的负电荷密度会随pH值的改变而改变,因此,对胃蛋白酶在TiO2表面上粘附时二级结构的变化进行了研究。通过研究胃蛋白酶在pH值变化过程中的二级结构变化情况,可以了解胃蛋白酶水解蛋白质的方式,阐明其生物活性与自身结构的关系。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  MB3000系列傅立叶变换红外光谱仪(ABB公司),配PN 022-19XX ATR附件,采用ZnSe ATR晶体(80 mm × 10 mm × 4 mm); PHB-4型便携式pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司); KQ3200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); AR224CN电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

  KBr(光谱纯,美国PIKE公司); 锐钛型TiO2粉体(南京天行新材料有限公司); 胃蛋白酶(Pepsin A,来源于家猪,EC号:232-629-3,酶活≧15000 NFU/m,生工生物工程(上海)股份有限公司)。其余试剂均为国产分析纯。

  2.2 实验方法

  2.2.1 胃蛋白酶样品溶液配制 将200 mg 胃蛋白酶粉末加入20 mL去离子水中,超声分散,得到10 mg/mL溶液。以稀HCl溶液(pH 1)和NaOH溶液(pH 13)调节胃蛋白酶溶液的pH值,得到7组不同pH值的胃蛋白酶样品溶液,用于红外光谱采集。

  2.2.2 ZnSe ATR晶体表面TiO2涂层的制备 将30 mg 锐钛型纳米TiO2(平均粒径为10 nm)充分分散在25 mL无水乙醇中,获得TiO2 悬浊液。将400 μL悬浊液滴在ATR晶体表面,使其均匀展开,当无水乙醇完全挥发后,以氮气吹扫掉表层的粉末,获得稳定的TiO2涂层,经计算,涂层厚度约为100 nm。

  2.2.3 胃蛋白酶红外光谱测试 胃蛋白酶粉末的红外谱图将采用KBr压片法获得。将1 mg胃蛋白酶粉末与1 g KBr在研钵中充分研磨,取0.5 g压成直径13 mm的透明片状样品,以空气为背景,测定红外光谱。胃蛋白酶溶液的紅外光谱采用ATR的方法获得。将2 mL胃蛋白酶溶液加入ATR液体池,以水为背景,测定其红外光谱。采用同样方法获得胃蛋白酶在TiO2涂层上的红外光谱。

  光谱采集波数范围为4000~400 cm1,扫描次数为64次,分辨率为4 cm1,每隔10 min采集一次光谱,共采集12次,每次实验持续时间为2 h。为了保证红外光谱仪的正常运行和光谱数据的一致性,环境温度保持为18℃~28℃,湿度为50%~75%[16] 。

  2.2.4 红外光谱数据处理 获得的红外光谱采用GRAMS/AI 9.2软件进行处理。由于H2O在光谱区域1640 cm1附近有强吸收,与蛋白质的酰胺Ⅰ吸收峰有重叠,所以,每个光谱都进行了水和水气的消减。胃蛋白酶的光谱经过二阶导数计算,对1700~1600 cm1的吸收峰进行数据拟合,得到各吸收峰面积,用于考察胃蛋白酶蛋白质骨架上的二级结构成分在pH值影响下的变化。

  3 结果与讨论

  3.1 胃蛋白酶在粉末和溶液状态下的结构对比变化

  由于所处外界环境的不同,空气中的粉末状胃蛋白酶和水环境中的胃蛋白酶的结构可能有所不同。图1为胃蛋白酶粉末、胃蛋白酶溶液在ZnSe ATR晶体表面和胃蛋白酶在TiO2涂层的ATR表面上的红外光谱图。光谱中展示的胃蛋白酶是未调节pH值的样品。在无涂层的ZnSe ATR晶体表面上,胃蛋白酶溶液的pH=3.62,在纳米TiO2表面上pH=3.10。胃蛋白酶的pH值的微小变化可能是由于TiO2表面上的羟基在水中微弱电离带来的额外的H+造成的。

  在胃蛋白酶KBr压片红外光谱(图1A)中,3700~2840 cm1区域出现了一个很宽的吸收谱带。这主要是胃蛋白酶吸收了空气中微量的水,H2O的对称和反对称伸缩振动和胃蛋白酶中酰胺键的NH伸缩振动的吸收峰由于形成氢键而变宽,主峰大约位于3300~3200 cm1之间。在胃蛋白酶溶液中,由于胃蛋白酶取代H2O分子占据了部分的ATR晶体表面,所以H2O的特征峰为负值。3000~2840 cm1的吸收峰主要是CH3、CH2的对称和反对称伸缩振动引起。由图1A可见,在纳米TiO2表面,CH3和CH2的峰特别明显,这是因为此时胃蛋白酶在水中带有负电荷,而TiO2带有正电荷,在静电力和氢键的作用下,胃蛋白酶更多地吸附在表面上,因此在ATR光谱上可以看到更多的烷烃特征基团。

  由图1B可见,在溶液状态下,胃蛋白酶在1725 cm1附近出现了羧酸羰基CO的伸缩振动峰[17]。这是因为溶液pH≈3~4,肽链两端及侧链上有很多的游离羧基与溶液中的H+结合,形成了COOH基团。KBr压片、无涂层的ATR表面和TiO2涂层的ATR表面上的胃蛋白酶的酰胺Ⅰ带的位置分别为1654、1634和1631 cm1,有明显的红移趋势。由于蛋白质多肽链中羰基氧原子大多与亚氨基氢原子形成氢键,所以当H2O存在时,H2O分子会破坏原有的氢键,取而代之的是作用力更强的羰基CO与H2O分子间的氢键。相比之下,CO间的电子云密度下降,酰胺Ⅰ发生红移。当晶体表面覆盖一层TiO2时,TiO2表面上的部分羟基和H2O分子竞争,与羰基CO形成氢键,所以此时的酰胺Ⅰ带进一步发生红移。同理,当肽键中的CO与NH之间的氢键作用减弱的同时,多肽链中的CNH弯曲振动频率增大,酰胺Ⅱ发生蓝移[6],因此会发生如图1B中的1539、1545和1547 cm1的谱带峰位变化。

  通常情况下,蛋白质中的酰胺基团产生9个振动谱带[18],选择其中的酰胺Ⅰ(1700~1600 cm1)作为研究蛋白质二级结构的数据分析对象,酰胺Ⅰ是由多肽链骨架振动产生的一个强谱带,对羰基的几何振动和氢键结构都非常敏感[19],因此对于二级结构的研究有很大价值。酰胺Ⅰ中不同的子峰对应不同的二级结构,根据文献[11,20]对各个子峰进行了归属,结果见表1。

  对酰胺Ⅰ进行二阶求导和高斯函数拟合,得到胃蛋白酶中各个二级结构的相对含量关系,如图2所示。

  曲线拟合结果见表2。在溶液状态下,胃蛋白酶在ATR晶体表面以及纳米TiO2表面的β-折叠结构分别增加了23%和34%,同时α-螺旋结构减少了16%和26%,β-转角结构也下降了11%与15%,这表明在H2O的作用下,胃蛋白酶的结构变得更加有序紧密; 另外,TiO2表面上的β-折叠结构含量更多,这是因为TiO2的存在使得不同肽链或同一肽链不同肽段间形成氢键所致。

  3.2 胃蛋白酶在不同pH值下的结构变化

  不同pH值下的红外光谱(图3A)表明,在1724 cm1附近出现了一个较小的特征吸收谱带,为多肽链C端或者是侧链游离羧基上的羰基CO伸缩振动峰。随着pH值增大,1724 cm1处的峰渐渐消失,1399 cm1处的羧酸根反对称伸缩振动谱带从无到有,逐渐增大,这是因为随着pH值升高,羧基逐步解离,以羧酸根形式存在。1634和1545 cm1处的峰是胃蛋白

  酶的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰,各pH值条件下峰的位置无明显变化,说明pH值未对多肽链骨架上羰基CO和氨基NH间的氢键产生影响。1455 cm1处的峰对应于CH3的不对称变角振动和CH2的变角振动,1242 cm1代表的是酰胺Ⅲ,1081 cm1是COH的伸缩振动谱带。

  采用红外光谱测得的胃蛋白酶中的各种二级结构与pH值的关系如图3B所示,随着pH值升高,胃蛋白酶结构中β-折叠结构增加,无规卷曲结构减少,表明此时肽链中形成了更多的氢键,属于变性过程中的中间态,仍具有部分的生物活性。随着pH值进一步增加,β-片层和螺旋结构这两种规则有序结构迅速减少,无规卷曲和β-转角呈明显增加的趋势,这是因为在碱性状态下胃蛋白酶趋于完全变性,多肽链开始解折叠,蛋白质的空间结构呈现无序松散的状态,已完全失去了原有的催化活性。

  3.3 TiO2表面上的胃蛋白酶在不同pH值下的结构变化

  图4A是TiO2表面上胃蛋白酶在不同pH值下的红外光谱,1725、1631、1547、1466和1402 cm1处分别出现了羧基上的羰基CO、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、CH3和CH2的变角振动及羧酸根反对称伸缩振动的红外吸收峰。如前所述,TiO2使酰胺Ⅰ发生红移,肽键羰基CO的氧原子电子云密度降低,使得侧链上的CH3、CH2基团的电子云密度升高,所以图4A中可见其特征吸收峰由1455 cm1移至1466 cm1,向高波数方向移动了11 cm1; 同理,酰胺ⅢCN的伸缩振动峰也从1242 cm1处移到1261 cm1附近,COH伸缩振动的吸收峰从1081 cm1藍移到1092 cm1。并且,在TiO2表面上的吸收峰强度明显高于没有涂层的ZnSe ATR晶体,说明在静电力和氢键的作用下,更多的胃蛋白酶粘附在TiO2表面上。

  由图4B可见,胃蛋白酶的二级结构变化与图3B不同,在各个pH值下的胃蛋白酶中的β-折叠结构含量都很高,随着pH值增大,总体呈微弱下降趋势,说明TiO2保持和增强了β-折叠结构中的氢键,使其不易发生解体; 同时,β-折叠含量远高于其它3种二级结构的含量,而其它二级结构在pH值变化的过程中含量均没有明显的变化,在此种情况下,胃蛋白酶中的空间结构非常致密紧实,更具有刚性。采用圆二色谱(CD)研究蛋白质在石墨烯上的构象变化[21],结果表明,蛋白质附着在石墨烯上,其构象变化较大,尽管在环境中存在石墨烯,未附着的蛋白质构象也没有明显变化,与本研究结果相吻合。

  4 结 论

  测定了胃蛋白酶的红外光谱,发现酰胺I带的红移和酰胺II带的蓝移,并发现在溶液状态下,胃蛋白酶的β-折叠含量增加,a-螺旋含量降低。随着pH值的增加,胃蛋白酶溶液的酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的吸收峰位置位发生明显变化,羧基中的羰基CO吸收峰逐渐消失,羧酸根反对称伸缩振动的吸收峰逐渐增大,β-折叠结构含量先增加后减少,无规卷曲结构含量先减少后增加。在TiO2表面上时,胃蛋白酶溶液的红外谱图中出现了强的COH伸缩振动峰,二级结构中的β-折叠结构比例维持在较高水平,随着pH值的增高而缓慢下降。对比胃蛋白酶溶液在无涂层的ATR和带有TiO2涂层的ATR表面上的红外光谱吸收峰强度发现,TiO2的存在有利于溶液中胃蛋白酶的吸附。

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文章名称:工业化工论文范文红外光谱法研究胃蛋白酶在表面上的构象变化

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